Exame a fresco

O exame a fresco é um método muito simples, consistindo na observação ao microscópio de células, pequenos organismos vivos ou fragmentos de tecidos vivos, num meio líquido o mais próximo possível do meio natural desses organismos.
A finalidade desse método é permitir a observação de estruturas “in vivo”, de modo a poder observar manifestações funcionais, como a ciclose, reações de estímulos, etc., além de ser importante na contraprova de outros métodos de estudo de estrutura celular que utilizem o estudo de células mortas.
Para que a célula sobreviva o maior tempo possível, é necessário o uso de líquidos chamados conservadores fisiológicos, os quais são soluções que proporcionam às células que estão sendo observadas, condições as mais aproximadas possíveis do seu ambiente natural. Isso possibilita um exame mais prolongado.
Podemos classificar os líquidos conservadores em naturais e artificiais:
Líquidos naturais: água doce (organismos aquáticos), água do mar (organismos marinhos), humor aquoso (do globo ocular de bovino), soro sangüíneo (técnicas de cultura de tecido), líquido amniótico, líquido ascítico (obtido de processos patológicos), etc.
Líquidos artificiais: soro fisiológico (0,9% NaCl para mamíferos), líquido de Ringer (NaCl, KCl, cloreto de cálcio, bicarbonato de cálcio), líquido de Knop (para órgãos e tecidos vegetais), etc.
A grande vantagem desse método é não produzir modificações nem na forma nem na função do objeto examinado, servindo portanto de contraprova para outros métodos. Outra vantagem é sua rapidez.
O emprego do exame a fresco está restrito dentro de certos limites: só se aplica a objetos finos e transparentes, não permite observações prolongadas e mostra apenas uma pequena parte dos detalhes das estruturas. É, portanto, relativamente grosseiro e leva eventualmente à morte celular.
O exame a fresco pode ser feito entre lâmina e lamínula, utilizando-se líquidos fisiológicos. O condensador deve ser abaixado nos microscópios comuns ou a observação deve ser feita em fase. Se for necessário, para evitar o esmagamento (por exemplo para visualizar o movimento de protozoários), deve-se suspender a lamínula entre quatro pilares de cera, ou utilizar o método da gota pendente, que tem a vantagem de criar uma micro-câmara úmida para observações prolongadas. Consiste na utilização de uma lâmina escavada, com uma lamínula contendo uma pequena gota de material nessa região. A gota deve ficar suspensa. A câmara assim construída deve ser vedada com parafina.

Coloração vital

O método da coloração vital constitui um procedimento intermediário entre a observação a fresco e a observação após a fixação. Constitui-se o uso de corantes não tóxicos que permitem que a células continuem vivas, embora penetrem facilmente no organismo.

Corantes vitais: azul de metileno
vermelho neutro
verde Janus (cora mitocôndria)
carmim Lítico.

Esses corantes se empregam em grandes diluições, de 1:500 até 1:100.000, variando a diluição para cada corante e cada uso. Por exemplo, se for injetado, ou se, simplesmente, o organismo for mergulhado no corante.
Esses corantes não reagem termicamente com nenhuma estrutura celular. A coloração vital se processa apenas por atração eletrostática entre o corante e a estrutura. Uma grande vantagem é ser possível demonstrar a existência real dos diversos elementos morfológicos revelados pelos materiais fixados. É uma técnica limitada, pelo pouco detalhe de estrutura que fornece.